Klinisch alleen, dus op basis van syphilis symptomen, kan de diagnose sindsdien niet worden gesteld syfilis symptomen kunnen sterk variëren en zijn niet specifiek. Daarom microscopisch en serologisch syphilis test moet worden uitgevoerd. Het is niet mogelijk om de bacterie T. pallidum op een kweekmedium te kweken. In de microscopische diagnose van de syphilis test, wordt een uitstrijkje van de huid genomen en slijmvliesveranderingen en de verkregen secretie wordt onderzocht onder een donkerveldmicroscoop. Onder een normale lichtmicroscoop is de bacteriën kunnen niet worden gedetecteerd omdat ze te dun zijn. Naast de typische structuur, kleine diameter, gelijkmatige spoelen, de snelle buiging en stretching beweging in het midden van het bacteriële lichaam is kenmerkend. Een positief testresultaat is een bewijs van de ziekte, maar een negatief resultaat sluit syfilis niet uit. Bij serologische diagnostiek worden antilichaamscreeningstests uitgevoerd die 2-4 weken na infectie positief zijn. Antilichamen worden gedetecteerd die zijn gevormd tegen antigenen op het oppervlak van de pathogene stof bacteriën. De TPHA-test (T. pallidum hemagglutinatietest, tegenwoordig ook wel TPPA-test genoemd) is een gevoelige en zeer specifieke zoekreactie waarin antilichamen tegen T. pallidum klomp (agglutinaat) rood bloed cellen (erytrocyten) geladen met T. pallidum-antigeen. Het wordt positief in de 2e week na infectie met syfilis en blijft dit nog vele jaren nadat de ziekte is genezen ("seronar"). In het vroege primaire stadium kan het nog negatief zijn. De test wordt gebruikt bij verdenking op syfilis, maar ook voor routinematige screening bij vroege zwangerschapVan bloed donoren en bloedconserven. Positieve resultaten vereisen een bevestigingstest: in de FTA-ABS-test (Fluorescence Treponema Antibody Absorption Test) bacteriën worden op een glijbaan gefixeerd en samengebracht met bloed serum, het vloeibare deel van het bloed. De antilichamen in het bloedserum hechten zich vervolgens aan de antigenen van de bacteriën. Na het spoelen van het serum worden de antilichamen opnieuw gelabeld met andere antilichamen die een fluorescerende kleurstof dragen. Onder de fluorescentiemicroscoop worden zo de antilichamen die tegen de bacteriën worden gezocht zichtbaar. De FTA-ABS-test is, net als de TPPH-test, positief in de 2e week na infectie en blijft positief in de zin van een seronlitteken jaren na klinische genezing. De VDRL-test (Venereal Disease Laboratory Test), ook bekend als de cardiolipine-flocculatietest, wordt gebruikt voor therapie en voortgang Grensverkeer. Deze syfilis-test wordt gebruikt voor de detectie van lipide-specifieke antilichamen, die verdwijnen naarmate de huidverschijnselen genezen. Cardiolipin is een antigeen dat wordt gewonnen uit de hart- van vee en gebonden aan cholesterol deeltjes. De geladen deeltjes worden samengebracht met het serum van de patiënt. In het positieve geval treedt flocculatie (agglutinatie) op. Deze test wordt 4-6 weken na infectie of 1-3 weken nadat het primaire effect optreedt positief. De hoeveelheid lipide-specifieke antilichamen neemt snel af naarmate de externe symptomen van syfilis genezen en niet langer aanwezig zijn na een succesvolle behandeling. Deze hoeveelheid (titer) kan worden gebruikt om te beoordelen of de therapie succesvol was of dat de syfilis onvoldoende werd behandeld. De VDRL-test kan echter ook positief zijn voor andere ziekten, dus het is kenmerkend voor maar niet specifiek voor syfilis. Een CSF-test wordt gedaan om neurosyfilis te bevestigen bij patiënten met neurologische symptomen van syfilis en om asymptomatische neurosyfilis op te sporen of uit te sluiten. Alleen antilichamen in CSF die ook zijn geproduceerd in het CZS bewijzen neurosyfilis, maar geen antilichamen die van serum naar CSF zijn gemigreerd. Dit kan worden bepaald door de titers van antilichamen in CSF en serum te vergelijken. Als de verhouding van CSF-titer tot serumtiter groter is dan 2, wordt neurosyfilis vermoed. Syfilis kan zich op veel verschillende manieren manifesteren, vooral de symptomen van de huid kan heel verschillend zijn: "Syfilis is de aap onder de huidziekten", dwz het kan bijna elke huidziekte nabootsen. Soms wordt Roseola syphilitica verward met drug exantheem, wat het resultaat is van drugsintolerantie. Het pijnlijke zweer molle, veroorzaakt door de bacterie H. ducreyi en andere huidveranderingen veroorzaakt door infecties (bijv granuloom venerum) moet worden onderscheiden van de zweer conditie.
