Patch-clamp-techniek is de naam die wordt gegeven aan een elektrofysiologische meettechniek. Hiermee kunnen ionstromen worden gemeten via individuele kanalen binnen een plasmamembraan.
Wat is de patch-clamp-techniek?
De patch-clamp-techniek of patch-clamp-methode behoort tot de elektrofysiologie, een tak van de neurofysiologie die zich bezighoudt met de elektrochemische overdracht van signalen in de zenuwstelsel Met behulp van deze methode is het mogelijk om individuele ionenkanalen in de celmembraan van een lichaamscel. Dit omvat het meten van stromen van enkele picoamperes. De patch-clamp-techniek werd voor het eerst beschreven in 1976 door de Duitse biofysicus Erwin Neher en de Duitse arts Bert Sakmann. De twee wetenschappers ontvingen in 1991 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde voor de ontwikkeling van de klem-patch-techniek. Zo werd elektrofysiologisch onderzoek virtueel gerevolutioneerd door de patch-clamp-techniek omdat het de mogelijkheid opende om elektrisch gedrag aan het membraan te observeren. eiwitten van individu moleculen De term patch komt uit de Engelse taal en betekent "patch". Het verwijst naar een klein membraangedeelte onder de patchpipet, dat wordt gebruikt als meetelektrode. Tijdens het meetproces wordt de membraanpleister gefixeerd of geklemd (vast te klemmen) op gespecificeerde potentialen.
Functie, effect en doelstellingen
De patch-clamp-techniek is een elektrofysiologische analysemethode. Het is gebaseerd op het biologische feit dat cellen een groot aantal poriën en ionenkanalen hebben. Binnen en buiten elke cel treden verschillende ionenconcentraties of ladingen op, die afhangen van de fysiologische toestand van de cel. De lipidedubbellaag van het membraan is niet doorlaatbaar water moleculen evenals ionen. Desalniettemin vindt een uitwisseling van geladen deeltjes plaats over de celmembraan met onregelmatige tussenpozen. De reden hiervoor is de spanningsafhankelijkheid van de ionenkanalen. Als een bepaald membraanpotentiaal wordt bereikt, worden de kanalen geopend volgens het principe van "alles of niets". Dit is precies waar de patch-clamp-techniek om de hoek komt kijken. Op deze manier wordt een meetpipet naar een ionenkanaal gebracht zonder de celmembraan Op deze manier kan het lokale elektrische potentieel nauwkeurig worden bepaald. Lekstromen, die het resultaat van de meting kunnen beïnvloeden, kunnen doorgaans worden vermeden door elektrisch extreem strakke verbindingen tussen de pipetrand en het celmembraan. De patch-clamp-methode is gebaseerd op de voltage-clamp-techniek. Deze techniek is in de jaren dertig ontwikkeld door de Amerikaanse biofysicus Kenneth Stewart Cole (1930-1900) om stromen op intacte zenuwcellen te meten. In de spanningsklem vindt het inbrengen van twee elektroden in een cel plaats om een commando of houdspanning te leveren. Tegelijkertijd wordt een andere elektrode gebruikt om de stromen te registreren die door het membraan optreden. Als neurofysiologen meer willen weten over de stroom van elektrische stromen door specifieke gebieden van a zenuwcel membraan, gebruiken ze de patch-clamp-techniek. Hiervoor gebruiken ze een fijne glazen pipet die aan de buitenkant van de cel wordt geplaatst. Negatieve druk kan worden gecreëerd door deze op te zuigen met behulp van een injectiespuit. Deze procedure zorgt ervoor dat het membraan op de corresponderende locatie lichtjes uitpuilt. De onderdruk zorgt ervoor dat het glas aan het membraan vastzit. Dit resulteert in elektrische isolatie van de kleine membraanvlek in de pipet van de rest van het membraan. Om de elektrische stromen te meten, gebruiken de neurofysiologen een patch-clamp-versterker. Dit is een speciaal meetinstrument. In het ideale geval kan de wetenschapper het apparaat gebruiken om informatie te verkrijgen over de elektrische eigenschappen van de afzonderlijke ionenkanalen. De ionenkanalen regelen bijvoorbeeld de in- en uitstroom van natrium ionen, die positief geladen zijn, in de zenuwcellen. Het onderzoek vindt plaats op de cellen van mensen, planten of dieren. De patch-clamp-methode wordt meestal uitgevoerd op een meetstation met verschillende apparaten. Op de trillingsgedempte meettafel bevindt zich een zogenaamde kooi van Faraday, die dient als elektrische afscherming. Verder is er een optische microscoop inclusief micromanipulator beschikbaar om de patchpipet in positie te brengen. Daarnaast heeft de pipethouder een aansluiting op een voorversterker, terwijl de monsterhouder is aangesloten op een badelektrode. De patch-clamp-versterker versterkt het voorversterkersignaal. Er is ook een monitor aanwezig om de DUT te observeren, evenals de patchpipet. Aan de meettafel zijn in de meeste gevallen ook een computer en meerdere dataopslagapparaten aanwezig om digitale opname mogelijk te maken.
Risico's, bijwerkingen en gevaren
Er zijn geen risico's verbonden aan de patch-clamp-techniek. Cellen van mensen, dieren of planten worden bijvoorbeeld pas onderzocht nadat ze zijn verwijderd. Onbeperkte toegang tot het buitenste celmembraan bestaat zelden. Om deze reden is het vaak nodig om de cellen voor te bereiden op de patch-clamp-methode. Na het vullen van de patchpipet wordt deze in een micromanipulator geklemd. Dit is verbonden met de patch-clamp-versterker en voorzichtig op een cel gedrukt die intact is. Het proces kan worden gevolgd met een monitor of microscoop. Onder de pipet zit een stuk membraan dat een membraanpleister wordt genoemd. De lichte onderdruk die aan de achterkant van de pipet wordt gecreëerd, zorgt voor een sterke verbinding tussen de pipet en het membraan. Dit proces resulteert in het creëren van een elektrische weerstand tussen de externe oplossing en de binnenkant van de pipet van enkele gigaohm. Wetenschappers noemen dit ook wel 'gigaseal', waarmee de celgebonden configuratie van de patch-clamp-methode kan worden bereikt. De stroom die door een ionenkanaal in de patch stroomt, vloeit ook door de inhoud van de pipet vanwege de hoge gigaseale weerstand. Een op de versterker aangesloten elektrode wordt ondergedompeld in de oplossing van de pipet, waardoor de activiteiten van individuele ionenkanalen binnen het patchmembraan kunnen worden gemeten.
