DNA-sequentiebepaling | Deoxyribonucleïnezuur - DNA

DNA sequencing

Bij DNA-sequencing worden biochemische methoden gebruikt om de sequentie van nucleotiden (DNA-basismolecuul met suiker en fosfaat) in een DNA-molecuul te bepalen. De meest gebruikte methode is de Sanger-kettingbeëindigingsmethode. Omdat DNA uit vier verschillende basen bestaat, worden er vier verschillende benaderingen gemaakt.

Elke benadering bevat het te sequencen DNA, een primer (startmolecuul voor sequentiebepaling), DNA-polymerase (enzym dat DNA verlengt) en een mengsel van alle vier de vereiste nucleotiden. In elk van deze vier benaderingen wordt echter een andere base chemisch zodanig gemodificeerd dat deze kan worden opgenomen, maar biedt deze geen actiepunt voor het DNA-polymerase. Dit leidt vervolgens tot ketenbeëindiging. Deze methode produceert DNA-fragmenten van verschillende lengtes, die vervolgens chemisch worden gescheiden door zogenaamde gelelektroforese op basis van hun lengte. De resulterende sortering kan worden vertaald in de sequentie van nucleotiden in de gesequentieerde DNA-sectie door elke base met een andere fluorescerende kleur te labelen.

DNA-hybridisatie

DNA-hybridisatie is een moleculair-genetische methode die wordt gebruikt om de gelijkenis tussen twee enkele strengen DNA van verschillende oorsprong te bewijzen. Deze methode maakt gebruik van het feit dat een dubbele DNA-streng altijd bestaat uit twee complementaire enkele strengen. Hoe meer beide enkele strengen op elkaar lijken, hoe meer basen een solide verbinding (waterstofbruggen) vormen met de tegenoverliggende base of hoe meer basenparen er worden gevormd.

Er zullen geen basenparen optreden tussen secties op de twee DNA-strengen die een verschillende basensequentie hebben. Het relatieve aantal verbindingen kan nu worden bepaald door het smeltpunt te bepalen waarop de nieuw gevormde dubbele DNA-streng wordt gescheiden. Hoe hoger het smeltpunt, hoe meer complementaire basen waterstofbruggen met elkaar hebben gevormd en hoe meer de twee enkele strengen op elkaar lijken. Deze methode kan ook worden gebruikt om een ​​specifieke basensequentie in een DNA-mengsel te detecteren. Hiervoor kunnen kunstmatig gevormde DNA-fragmenten worden gelabeld met (fluorescerende) kleurstof. Deze dienen dan om de overeenkomstige basenvolgorde te markeren en kunnen deze dus zichtbaar maken.