De polymerasekettingreactie vertegenwoordigt een procedure uit de moleculaire biologie die secties van genetisch materiaal dupliceert (desoxyribonucleïnezuur, DNA). Miljoenen identieke kopieën worden gemaakt van minieme hoeveelheden DNA. Op deze manier zijn hoeveelheden beschikbaar die voldoende zijn voor verschillende onderzoeken.
Wat is de polymerasekettingreactie?
De polymerasekettingreactie vertegenwoordigt een methode uit de moleculaire biologie die secties van genetisch materiaal dupliceert (desoxyribonucleïnezuur, DNA). De term polymerasekettingreactie (PCR) beschrijft de in vitro (Latijn: in het glas) reactie met behulp van een enzym, de polymerase (DNA-polymerase), die leidt tot de duplicatie van bepaalde gen opeenvolgingen. Het product van de reactie is ook het uitgangsmateriaal voor een nieuwe cyclus van deze reactie. Het aantal moleculen verdubbelt en dient tegelijkertijd als sjabloon voor een nieuwe cyclus. Dit wordt exponentiële vermenigvuldiging genoemd. Het vindt plaats in het laboratorium met een hoge snelheid van enkele minuten, vergelijkbaar met een kettingreactie. Dit laboratoriumproces bootst de duplicatie van genetische informatie (DNA) na die plaatsvindt onder natuurlijke omstandigheden tijdens replicatie. De Amerikaanse chemicus KB Mullis wordt beschouwd als de ontdekker van dit proces. In 1983 introduceerde hij dit DNA-syntheseproces en tien jaar later ontving hij de Nobelprijs voor de chemie.
Functie, effect en doelen
In levende organismen komt het DNA in chromosomen heeft een lengte die niet kan worden versterkt met PCR. In plaats daarvan wordt het toegepast om een gedefinieerde sectie te versterken. Dit kunnen genen zijn, een specifiek onderdeel van een gen, of regio's die niet zijn getranscribeerd in eiwitten, dat wil zeggen, zijn niet-coderend. Deze secties bevatten meestal niet meer dan drieduizend basenparen, vergeleken met ongeveer twee keer drie miljard basenparen per set chromosomen in mensen. De polymerasekettingreactie vereist een enkel- of dubbelstrengs DNA-keten waarvan de structuur ten minste gedeeltelijk bekend moet zijn. Naast het enzym, het polymerase, worden twee primers gebruikt. Dit zijn bouwstenen van het DNA die als begin- en eindpunt dienen. Ze worden gekenmerkt door een sequentie die exact overeenkomt met de regio die moet worden geamplificeerd. In het laboratorium wordt de polymerasekettingreactie uitgevoerd in een programmeerbaar verwarmingsblok. De nodige componenten zoals polymerase, primer, de bouwstenen om de nieuwe streng te bouwen (deoxyribonucleoside trifosfaten) en magnesium ionen worden bij elkaar opgeteld in een bufferoplossing. Het temperatuur-tijdprogramma voor de reactie begint met denaturatie bij een temperatuur boven 94 ° C. Bij dit proces wordt het dubbelstrengs DNA gesplitst en is het aanwezig in enkelstrengs vorm. In de volgende stap, bij ongeveer 70 ° C, wordt de primer gebonden aan de gen sequentie en vormt het startpunt voor de enzymreactie. Vanaf hier synthetiseert het polymerase de complementaire streng. Een nieuwe cyclus begint dan, opnieuw bestaande uit de drie stappen van denaturatie, primerbinding en synthese van de DNA-streng. De polymerasekettingreactie wordt gebruikt in de forensische geneeskunde, klinische diagnostiek en klinisch onderzoek. In de forensische wetenschap wordt DNA gewonnen uit huid, speeksel, haar, sperma of bloed van plaats delict en, na versterking, vergeleken met bekende steekproeven en gebruikt om specifieke individuen te identificeren. Met behulp van deze genetische vingerafdruk kan het vaderschap ook worden opgehelderd in een aangepaste benadering. Bij de opheldering van ziekten wordt de polymerasekettingreactie gebruikt om de betrokken genen te verifiëren. Sommige bacteriële ziekten kunnen worden geclassificeerd door specifieke sequenties te herkennen. Virale ziekten kunnen worden gekarakteriseerd wanneer het virale DNA of RNA wordt getransformeerd en geamplificeerd. In bloed screening is het mogelijk om te detecteren hepatitis of door hiv gemedieerde ziekten in een zeer vroeg stadium. Bij tumordiagnostiek wordt het gebruikt om tumorcellen te identificeren. Dit maakt het mogelijk om de tumor te classificeren, het verloop van de ziekte te beoordelen, het succes van de therapie en de prognose. In onderzoek wordt de polymerasekettingreactie gebruikt om genen te identificeren die geassocieerd zijn met verschillende ziekten.Voor genklonen, wat niet hetzelfde is als het klonen van een organisme, wordt het gen geamplificeerd voordat het wordt overgedragen naar andere organismen in een vector (Latijn: reiziger, drager ). Deze kunnen dienen als modellen om ziekten beter te bestuderen of te produceren eiwitten die kan worden gebruikt als drugs.
Risico's en gevaren
De polymerasekettingreactie heeft een enorm potentieel bij het detecteren van minieme hoeveelheden DNA. Om te profiteren van de veelheid aan mogelijkheden en om te waken tegen gedenkwaardige fouten, moet rekening worden gehouden met bepaalde voorwaarden en verschillende bronnen van fouten. Alleen delen van het genetisch materiaal waarvan de sequentie ten minste gedeeltelijk bekend is, kunnen worden geamplificeerd. Volledig onbekende sequenties kunnen met deze methode niet worden geamplificeerd. De producten van een versterking kunnen achteraf worden gevisualiseerd. Als het verwachte signaal niet zichtbaar is, hoewel de gezochte reeks aanwezig was, is er een vals negatief resultaat. Meestal is dit het resultaat van niet-geoptimaliseerde of slecht geoptimaliseerde reactieomstandigheden. Deze moeten worden bepaald als functie van de doelsequentie. Hiervoor worden verschillende temperatuur- en tijdprofielen, primersequenties en hoeveelheden en concentraties van andere stoffen in het reactiemengsel getest. Fout-positieve resultaten verschijnen als signalen die niet aan het gewenste product kunnen worden toegewezen. Grote problemen ontstaan door besmetting met DNA afkomstig van de onderzoeker of van een andere dan de te analyseren bron. DNA van bacteriële oorsprong heeft ook invloed op het resultaat van een polymerasekettingreactie. Door handschoenen te dragen en goed op te letten, kunnen dergelijke fouten worden voorkomen en kunnen betrouwbare conclusies over de versterkte producten worden geformuleerd.
