Let op: het volgende artikel is opgenomen onder andere conventionele therapieën omdat er nog geen aparte sectie beschikbaar is voor experimentele moleculaire biologiemethoden buiten de menselijke geneeskunde. De CRISPR / Cas-methode is een moleculair biologische methode voor het gericht knippen en modificeren van DNA (genome editing; gen schaar). In 1987 ontdekten wetenschappers een voorheen niet waargenomen adaptief immuunsysteem in E. coli. Dit is gebaseerd op zogenaamde CRPSPR-sequenties (geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindrome herhalingen) in het DNA. E. coli integreert het DNA van bacteriofagen (groepen van virussen die gespecialiseerd zijn in bacteriën als gastheercellen) de CRSPR-sequentie van zijn eigen DNA, waardoor een crRNA wordt getranscribeerd (DNA herschrijven in RNA). Het crRNA bestaat uit zowel spacer- als herhalingssequenties. Spacer-sequenties zijn de sequenties die zijn "geëxtraheerd" uit de bacteriën Het zogenaamde trRNA (tracrRNA) bindt zich aan benoemde herhalingssequenties. Het rekruteert het CAS9-enzym. Er is nu een complex aanwezig - het crRNA: tracrRNA: Cas9-complex - dat in staat is bacteriofaag-DNA te binden dat complementair is aan de ruimtesequenties van het crRNA. Als zogenaamd endonuclease (DNA-snij-enzym, dus een restrictie-enzym) knipt CAS9 het virale DNA dubbelstrengs, wat uiteindelijk leidt tot onvermogen tot replicatie (dwz geen verdere replicatie en dus geen verdere integratie). Deze procedure wordt al meer dan een decennium met de nadruk gebruikt in onderzoek naar genoomredactie. Het beschreven “crRNA: tracrRNA: Cas9-complex” is universeel toepasbaar op planten en dieren en maakt verwijdering (deletie) en uiteindelijke uitschakeling van genen mogelijk. Al meer dan 5 jaar wordt een gebruik buiten het onderzoek gevonden in landbouw- en voedselgewassen voor droogtetolerantie en immunisatieverbetering tegen virale pathogenen. De procedure zou later mogelijk in de menselijke geneeskunde kunnen worden gebruikt. Sinds 2020 is er voor het eerst een curatieve therapeutische benadering voor een aangeboren ziekte hart- defect (vitium) bij kinderen. Vitium maakt deel uit van de complexe erfelijke ziekte Noonan-syndroom (autosomaal recessieve of autosomaal dominante overerving). Na het ontcijferen van de causale varianten van de LZTR1 gen, passende gencorrectie van de gegenereerde geïnduceerde pluripotente hartspiercellen (hart- spiercellen) uit stamcellen van de tweeling werd uitgevoerd. De gen reguleert essentiële signaalroutes voor celdifferentiatie en groei.
Vóór deze mogelijke therapie in de menselijke geneeskunde
Moleculair genetisch testen voor erfelijke aandoeningen bij ouders, inclusief uitgebreid genetische counseling.
De procedure
De procedure is vergelijkbaar met die van het afweermechanisme van E. coli beschreven in de immuunsysteem In dit proces kan het spacergedeelte van crRNA worden gemodificeerd om sequentiespecifiek dubbelstrengs complementair DNA te knippen, wat resulteert in gerichte deleties. Het chemisch gemodificeerde trRNA: crRNA-molecuul wordt guideRNA genoemd. Hiervoor zijn twee verschillende crRNA's nodig: tracrRNA: Cas9-complexen om zich aan twee plaatsen op het DNA te hechten. Na verwijdering van het DNA-fragment vindt enzymondersteunde koppeling van de 2e DNA-fragmenten plaats door ligasen. Dit verschilt van het louter knippen van een DNA-sequentie zoals bij de bacterie. In de loop der jaren zijn er essentiële modelleertechnieken aan toegevoegd. Deze maken niet alleen deleties binnen de DNA-streng mogelijk, maar ook de toevoeging (inserties) van nieuwe DNA-nucleotiden. De meest veelbelovende wijziging is primaire bewerking. Hier wordt een deletie en dus verwijdering van een DNA-fragment gevolgd door het inbrengen van een nieuw DNA-fragment. Het zogenaamde pegRNA (prime editing guide RNA) is hier beschikbaar als het transcript van het in te brengen DNA. Met behulp van een reverse transcriptase wordt het pegRNA getranscribeerd in DNA en opgenomen in het DNA, wederom met behulp van ligasen. Het CAS9-eiwit dat voor dit proces nodig is, genereert enkelstrengs in plaats van dubbelstrengs sneden. Hierdoor kan het nieuwe DNA-fragment precies in de gesneden DNA-streng met de uitstekende uiteinden worden ingebracht. De nieuwe modificatie is fundamenteel voor het in de toekomst uitwisselen van de "pathologische" DNA-sequentie volgens de "niet-pathologische" in de context van een erfelijke ziekte.
Na therapie
Opnieuw wordt genoomscreening uitgevoerd om het succes van genoombewerking te bevestigen.
Mogelijke complicaties
Vanwege mogelijke basismismatches van guideRNA, kunnen off-target effecten, dwz binding op de ongewenste plaats, optreden. Deze kunnen puntmutaties (basisveranderingen), inserties (opname van extra nucleotiden of DNA-sequenties in een DNA-sequentie), deleties (verlies van ...), translocaties (verandering in positie van DNA) en inversies (aanwezigheid van een DNA-segment 180 graden). Het CAS9-enzym snijdt niet in alle gevallen op de gewenste locatie. Verhogingen in specificiteit zijn echter al gerealiseerd door veranderingen in het eiwitontwerp. Ook door CAS9 te koppelen aan een endonuclease Fokl, ook afgeleid van bacteriën, specificiteit kan worden verhoogd tot 1: 10,000 (zonder andere wijzigingen, alleen specificiteit tot 1: 2).
